聚醚類藥物殘留測定方法（一）

[db:作者] / 2022-12-26 00:00

20.1.4.2 測定方法

目前已報道的PEs殘留檢測方法主要有微生物法(MA)、免疫分析法(IA)、薄層色譜法(TLC)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)等。

(1)微生物法(microbiological analysis，MA)

微生物法具有試樣前處理簡單、快速、樣品容量大、儀器化程度及分析成本低的優點，常作為篩選方法應用在PEs殘留分析中。PEs的微生物分析法常用管碟瓊脂擴散法，即將敏感試驗菌均勻涂布于瓊脂培養基表面，向有一定體積的牛津杯(小鋼管)加入一定量含抗生素的溶液，使其在培養基上進行擴散滲透，從而產生透明抗生素抑菌圈。在一定濃度范圍內，抗生素總量的對數與抑菌圈直徑的平方呈線性關系，從而對抗生素進行定量分析。潘蘊慈等用高敏感的嗜熱脂肪芽孢桿菌(C-953)作為實驗用菌對肉雞肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織中的SAL殘留進行測定。用雙碟平板培養敏感菌，通過細菌的抑制效應對藥物進行檢測，用標準曲線定量。組織樣品加甲醇勻漿并提取，加四氯化碳LLP凈化，再經硅膠層析柱凈化后進行測定。標準溶液效價濃度的線性范圍為0.05～0.2r，回收率為69.82%～75.79%，方法LOD可以達到0.22mg/kg。李娜建立了雞組織中SAL、MON和MAD的微生物檢測方法。向勻漿后組織加入PBS，振蕩30min后，100℃水浴3min，冷卻后離心提取組織中的藥物，采用管碟法進行檢測。試驗篩選出MON的敏感菌為金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，SAL的敏感菌為枯草芽孢桿菌，MAD的敏感菌為短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。該方法回收率均大于60%，RSD在15%以內；MON、SAL和MAD在各組織中的LOD范圍分別為1.25～1.5μg/g、0.4～0.6μg/g和1.75～2.0ug/g。

(2)免疫分析法(immunoanalysis，IA)

免疫分析法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結合為基礎的新型分析技術。目前應用于PEs分析的主要有酶聯免疫吸咐測定法(ELISA)和熒光免疫分析法(FIA)等。

1)酶聯免疫分析法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)

ELISA是基于抗原或抗體的固相化及其酶標記技術的一種免疫測定方法。底物通過與酶反應催化成為有色產物，產物的量與試樣中待測物的量直接相關，從而對待測物進行定性或定量分析。Elissalde等建立了快速ELISA法，用以測定畜禽肝組織中SAL和NAR殘留。用SAL-小牛血清蛋白(BSA)制備了16種抗SAL的單克隆抗體，這16種單克隆抗體在10μg/kg范圍內用于識別SAL及與其結構相似的NAR用篩選出的抗體“SAL05”建立了一種競爭性ELISA方法進行檢測。樣品處理用pH7.2的Tris-HCl緩沖液勻漿提取，提取液用上述ELISA法檢測。該方法平均添加回收率為87%，標準曲線線性相關系數為0.9838，SAL和NAR的IC50值分別為(0.33±0.10)ng/孔(0.52+0.62)ng/孔，LOD為1000ng/孔。Muldoon等采用ELISA技術建立了雞肝組織中SAL的檢測方法。用免疫蛋白G柱純化腹水中的抗SAL單克隆抗體，建立了競爭性抑制ELISA方法。組織樣品提取緩沖液(pH7.75)包括水、Tris-HCl、Tris堿、氯化鈉、NFDM和吐溫20，離心提取液后再用該緩沖液稀釋，供ELISA檢測。方法添加回收率為83%，LOQ為50μg/kg；與高效液相色譜方法的相關性高(p<0.0001)，且更為靈敏。Godfrey等建立了雞組織中MON的化學發光酶聯免疫吸附(cELISA)定量測定方法。通過酶水解從雞組織中提取MON，再用IAC凈化，最后用cELISA定量測定。雞不同組織中MON的LOD范圍在0.09μg/kg(肝臟)和1.99μg/kg(皮膚)之間，肝臟和皮膚的回收率分別為101.05%±10.67%和80.99%±0.19%。

2)熒光免疫分析法(fluorescence immunoassay，FIA)

FIA常用標記免疫測定法，以熒光物質或潛在的熒光物質作為標記物，結合免疫反應和標記物的發光分析，通過熒光檢測器檢測抗原抗體復合物中特異性熒光強度，從而對待測物進行定性或定量分析。Peippo等建立了雞肉和雞蛋中NAR和SAL殘留的時間分辯熒光免疫測定法(time-resolved fluoroimmunoassay，TR-FIA)。雞蛋試樣用乙腈提取一次并蒸干，復溶；肌肉試樣需要再增加硅膠SPE凈化，洗脫液為乙腈。用鑭系元素銪標記NAR-轉鐵蛋白結合物，競爭性TR-FIA檢測定量。NAR和SAL的平均回收率分別為81.1%和91.0%，LOD分別為0.28μg/kg和0.56μg/kg。TR-FIA同時檢測熒光波長和時間兩個參數進行信號分辨，有利于排除非特異熒光的干擾，而且鑭系元素螯合物Stokes位移較大、發射光譜帶窄、熒光壽命長，極大地提高了分析靈敏度和特異性。Wang等建立并優化了用特異性多克隆抗血清檢測MAD的熒光偏振免疫測定(FPIA)的方法。MAD-BSA作為免疫原，熒光標記MAD用活化酯法合成，標記物為異硫氰酸熒光素乙二胺(EDF)，薄層色譜純化。雞組織樣品和全蛋樣品用甲醇提取MAD，離心后除去脂滴，900μL硼酸緩沖液(BB)中加入100μL雞組織甲醇上清液，或者800μL BB中加入200μL全蛋甲醇上清液，稀釋后FPIA測定。該方法動態范圍在0.01～5.6μg/mL之間，IC50為0.16μg/mL，LOD為0.002μg/mL；雞肌肉、脂肪和蛋組織在0.25μg/g、5μg/g和10μg/g添加水平的回收率在82%～130%之間。

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