β-受體激動劑殘留分析技術

時間：2023-03-25 08:22:41來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

β-受體激動劑殘留分析技術

[db:作者] / 2022-12-08 00:00

1.1.4.1 前處理方法

目前，β-受體激動劑分析涉及的動物源基質主要包括尿液、肝、腎、血液、肌肉等，液液萃取、固相萃取、超臨界萃取、雙相滲析膜分離等現代前處理技術不斷應用到β-受體激動劑的殘留分析中來。

(1)提取方法

樣品的處理方式會對β-受體激動劑殘留分析最終結果產生影響。例如，肝臟在均質過程可能會激活一些降解酶，導致克倫特羅殘留量顯著降低；而肝臟和肌肉不經過均質處理，直接在-30℃條件下保存，克倫特羅殘留濃度在5個月內沒有顯著變化。

β-受體激動劑，尤其是苯酚型藥物如沙丁胺醇，在生物樣品中往往會形成結合物，如與葡糖苷酸酶、硫酸酯蛋白相結合。因此，在樣品提取前需要先進行水解，釋放出游離態的藥物。目前常用的水解方法包括酶解、酸水解和堿水解。酸水解法中采用的多為稀鹽酸、稀磷酸或高氯酸溶液，在水解解除絡合作用的同時，還有去除蛋白的作用；堿水解則一般在高溫水浴下進行，用于去除蛋白之間二硫鍵；酶解則是現在采用最多的方法，常用的酶主要有枯草桿菌蛋白酶、葡萄糖醛酸酶、硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶等，使用時通過調節樣品的pH，使之達到最佳酶解效果。

Haasnoot等研究發現，在尿中約有85%的非諾特羅是以葡萄糖苷酸酶化-硫酸酯蛋白化結合物形式存在。Bogd等對有無酶解步驟對肝臟中沙丁胺醇的提取效果進行比較試驗，發現酶解后的結果明顯高于未酶解的，約有40%～45%的沙丁胺醇以結合態存在。他們在測定沙丁胺醇時，對β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶的用量、酶解時間和水解環境進行了研究。當pH為5.2，酶量為1000個單位，溫度37℃，水解2h后測得的沙丁胺醇含量趨于穩定。但是，目前還沒有數據證明生物樣品中的克倫特羅是以結合態的形式存在。

對于以游離態存在的藥物，可以直接采用緩沖液或有機溶劑進行提取，影響提取效率的主要為有機溶劑的選擇性和緩沖液的pH。常見的提取溶液有乙酸鈉緩沖液(pH5.2)、0.1mo/L高氯酸溶液、3%三氯乙酸、乙腈、乙酸乙酯等。劉敏等]比較了乙酸銨提取法、乙腈直接提取法及10%碳酸鈉-乙腈溶液提取法對豬肝臟中9種β-受體激動劑殘留的提取效果。結果表明，乙酸銨提取法對非諾特羅和噴布特羅等藥物的回收率較低(小于20%)：乙腈直接提取法可有效提取出噴布特羅，其回收率達79%，但對非諾特羅的回收率僅為32%；而10%碳酸鈉-乙腈溶液提取9種藥物的效果明顯好于其他兩種方法，除了非諾特羅的回收率為72%外，其他8種藥物的回收率均在80%以上。基于此建立的豬肝臟中9種β-受體激動劑殘留檢測的高效液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)，在優化條件下，9種藥物在0.50～25ug/kg范圍內線性關系良好，相關系數(r)均大于0.99；在0.50ug/kg、2.0ug/kg、10μg/kg三個加標水平的回收率為71%～105%，相對標準偏差(RSD)均小于15%；9種藥物的檢出限均達0.2ug/kg。

(2)凈化方法

β-受體激動劑殘留分析常用的凈化方法有液液分配法(LLP)、固相萃取法(SPE)、基質固相分散萃取法(MSPD)等。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

采用LLP凈化提取液中克倫特羅等β-受體激動劑時，往往需將pH調到10以上，再采用乙酸乙酯等有機溶劑進行萃取。對于沙丁胺醇等極性較高的藥物，需要在提取溶劑中加入相應的極性組分如異丙醇等來提高萃取效率。金玉娘等建立了同時檢測11種β-受體激動劑(包括沙丁胺醇、特布它林、塞曼特羅、塞布特羅、萊克多巴胺、克倫特羅、溴布特羅、苯氧丙酚胺、馬布特羅、馬噴特羅、溴代克倫特羅)在豬肉及豬肝臟中殘留量的LC-MS/MS方法。將樣品粉碎后，用pH5.2的乙酸鈉緩沖液提取，經β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶水解，以高氯酸調節pH，離心沉淀蛋白，分離得上清液，再用異丙醇-乙酸乙酯(6+4，v/v)萃取，再過陽離子交換柱凈化、吹干后，用LC-MS/MS測定，同位素內標定量。目標化合物的回收率在89.4%～110.5%之間，RSD為1.1%～2.8%，方法的最低檢出限為0.25ug/kg。van der Vlis等建立了一種在線液液電萃取-等速電泳-毛細管區帶電泳-電噴霧質譜(EE-ITP-CZE-ESP-MS)方法分析鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、特布它林和非諾特羅。在高電場力作用下，通過液液萃取快速將離子化的β-受體激動劑從低導電率的有機溶劑萃取到一個小體積的緩

沖溶液中，而ITP使分析物遠離液-液界面，再經毛細管區帶電泳-電噴霧質譜測定。鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和特布它林的檢測限可達到2×10mol/L，非諾特羅為5×10mol/L。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

β-受體激動劑主要采用陽離子交換和反相SPE柱進行凈化。近年來，以SPE為分離載體的免疫親和柱(IAC)和分子印跡柱(MIP)等也開始應用。

Whaites等問將牛尿酸化后，用陽離子交換樹脂凈化，洗脫后再用乙酸乙酯萃取，衍生化后用氣相色譜-質譜(GC-MS)檢測，內標法定量。增加取樣量到50mL時，克倫特羅檢測限可達到0.01ng/mL，平均回收率超過70%，變異系數(CV)低于15%。Liu等測定豬肌肉和肝臟中20種β-受體激動劑，樣品經β-葡萄糖醛酸酶水解后，用PCXSPE柱凈化，使用LC-MS/MS測定。在肌肉和肝臟中，檢測限(CCa)范圍分別為0.05～0.23ugkg和0.05～0.57 ug/kg，檢測能力(CCβ)范圍分別為0.11～0.4ug/kg和0.16～0.79μg/kg。金玉娥等“測定豬肉及豬肝臟中11種β-受體激動劑，異丙醇-乙酸乙翻(6+4，v/v)萃取液采用MCX陽離子交換柱凈化，目標化合物的回收率在89.4%～110.5%之間，RSD為1.1%～2.8%。

聶建榮等建立了動物尿液中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅、馬布特羅、妥布特羅、班布特羅、馬噴特羅、塞布特羅、齊帕特羅、福莫特羅、氯丙那林、特布它林、噴布特羅和溴布特羅等15種β-受體激動劑的分析方法。樣品用高氯酸溶液酸解及沉淀蛋白質，經HLB SPE柱凈化、富集后，用LC-MS/MS測定。15種β-受體激動劑在0.25ug/L、1.0ugL、10ug/L添加水平下的回收率為62.1%～107%，RSD為3.5%～9.9%，定量限(LOQ)為0.25ug/L。Koole等則用標準密度的C8提取盤，從人尿和牛尿中提取凈化克倫特羅，再用甲醇-0.01mo/L氫氧化鈉(25+75，v/v)洗脫，高效液相色譜(HPLC)測定。克倫特羅的回收率為85%，檢測限為10ng/mL。

Zhang等以丙烯酰胺為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)作為交聯劑，采用本位聚合方法合成了嵌入銅(Ⅱ)的聚合物，對小牛血清蛋白(BSA)具有較強的結合性。該聚合物被用作固定克倫特羅多克隆抗體(pAb)的新型載體，制備出IAC柱。0.1g該固相填料對克倫特羅的最大吸附容量為616ng，食物樣品中的提取回收率為84.4%～95.2%，RSD為9.3%～15.5%。反復使用30余次，仍然具有特異性識別。

Van Hoof等l為減小基質效應對液相色譜-質譜(LC-MS)定量的影響，對Clean Screen Dau(CSD)和MIP SPE柱凈化尿液中β-受體激動劑的效果進行了比較。首先制備出β-受體激動劑的MIP柱，通過使用不同的制備材料、洗脫溶液和洗脫溶劑，優化出適宜的凈化條件。實驗顯示，CSD對一些β受體激動劑存在假陰性結果，而MIP的選擇性更好。

3)基質固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion，MSPD)

最常用的MSPD吸附劑主要為C18。Home等采用MSPD技術對牛肝中的克倫特羅進行提取凈化，使傳統操作過程得到簡化。首先將酶解后的組織試樣與MSPD等級的C18吸附劑均勻混合后填柱，用不同的溶劑對雜質和目標物分別進行洗脫，采用放射免疫方法檢測，方法回收率在86%～96%之間。洪振濤等將均質后的試樣與C18、石墨化碳黑、中性Al2O3混合研磨后裝入層析柱，分別用正己烷和氨化甲醇洗滌和洗脫試樣中的克倫特羅和沙丁膠醇，再用GC-MS測定。添加濃度為0.05～25.0ug/kg時，樣品回收率在94.82%～107.69%之間，CV小于5.52%，克倫特羅和沙丁胺醇的檢出限分別為0.0096ug/kg和0.0078 ug/kg。

4)超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，SFE)

隨著新的凈化技術的發展，一些新技術如超臨界流體萃取法(SFE)等，也開始應用到β-受體激動劑殘留分析的前處理中。Jimenez-Carmona 等國對離子對-SFE提取凈化食品基質(飼料、冷凍干燥的牛奶和肝)中克倫特羅的技術進行了研究。將食品基質與硅藻土混合，再加入樟腦磺酸，作為抗衡離子與克倫特羅形成極性很小的離子對，使之更容易溶解于超臨界CO2。SFE在383bar、40℃下動態提取30min。方法回收率在12%～87%之間，RSD為15%。

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