硫脲嘧啶類藥物殘留分析技術——提取方法

[db:作者] / 2022-12-22 00:00

19.1.4 殘留分析技術

19.1.4.1 樣品處理方法

硫脲嘧啶類藥物由硫脲嘧啶和巰基咪唑衍生而來，均為極性雜環兩性化合物，分子量小，提取、凈化和分析都是挑戰。首先，要從生物基質中把它的互變異構體提取出來；其次，要利用合理凈化手段，有效去除生物基質中的干擾雜質；再次，要改善分子結構，降低化學極性，增強檢測特異性和靈敏度。

(1) 提取方法

硫脲嘧啶類藥物極性較強，動物基質中殘留的硫脲嘧啶類藥物可以采用乙酸乙酯、甲醇、乙腈和二氯甲烷等多種有機溶劑提取，而乙酸乙酯是采用最多的有機試劑。

Buick等用乙酸乙酯直接提取牛甲狀腺和血清中的甲巰咪唑、硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、丙基硫脲嘧啶、苯基硫脲嘧啶。提取甲狀腺時，加入0.1mol/L EDTA；提取血清時，加入15μL巰基乙醇。高效液相色譜(HPLC)測定，甲狀腺中5種藥物的回收率在18.0%～75.4%之間，日間變異系數(CV)不超過25.88%，檢測靈敏度為2.45～4.52ng/g；血清中5種藥物的回收率在40.0%～92.6%之間，日間CV不超過26.67%，檢測靈敏度為16.98～35.25ng/mL。Blanchflower等開發了甲狀腺中的甲巰咪唑、硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、丙基硫脲嘧啶、苯基硫脲嘧啶的液相色譜-質譜(LC-MS)檢測方法。3g樣品中加入50μL 0.1mol/L EDTA、15uL巰基乙醇和1g無水硫酸鈉，再加入10mL乙酸乙酯均質提取。該方法添加回收率在48.1%～95.8%之間，檢測靈敏度在25ng/g左右。我國國家標準GB/T20742-2006規定 了牛甲狀腺和牛肉中硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、巰基苯并咪唑殘留量的液相色譜.串聯質譜(LC-MS/MS) 測定方法。采用10mL乙酸乙酯、3g無水硫酸鈉、20μL巰基乙醇和30μL 0.1mol/LEDTA提取。該方法回收率在82.8%～92.9%之間，CV在5.23%～9.48%之間，定量限(LOQ)均為2μg/kg。GB/T21310- 2007也采用了類似的提取方法，規定了動物源性食品中硫脲嘧啶、甲巰咪唑、甲基硫氧嘧啶、丙硫氧嘧啶、苯基硫氧嘧啶和2-巰基苯并咪唑等6種甲狀腺拮抗劑殘留量的LC-MSMS檢測方法。研究發現，用乙酸乙酯提取時，加入EDTA、巰基乙醇可以破除蛋白結合，提高硫脲嘧啶類藥物的回收率，而無水硫酸鈉鹽析作用可使極性化合物由水相轉入有機溶液；同時，超聲波水浴在提取中的廣泛使用，可以保證樣品中的硫脲嘧啶類藥物被充分提出。

Zakrzewski等報道了測定血清中3種硫脲嘧啶類藥物的薄層色譜(TLC)方法。采用甲醇稀釋、提取后TLC測定，檢測靈敏度在0.75～2.5nmoL/mL之間。Pinel等采用甲醇在超聲波水浴中提取凍干組織(肌肉、肝臟和甲狀腺)中的8種硫脲嘧啶類藥物，經凈化后用LC-MS/MS測定。該方法檢測限(CCa)為0.1～5.2μg/L，檢測能力(CCβ)為2.6～23.2μg/L，滿足歐盟100μg/L的臨時最低要求的性能極限(the provisional minimum required performance limit，MRPL) 要求。De Wasch等采用甲醇提取甲狀腺中的巰基苯并咪唑、硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、丙基硫脲嘧啶、苯基硫脲嘧啶和甲巰咪唑，經固相萃取凈化和衍生化后，用LC-MS測定。6種藥物的CCβ均為20μg/kg。

Yu等采用乙腈提取牛肉中的硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、丙基硫脲嘧啶、苯基硫脲嘧啶，經凈化和衍生化后用氣相色譜-質譜(GC-MS)測定。該方法回收率在50%～90%之間，CV小于10%；硫脲嘧啶的LOQ為25μg/kg，其他藥物為15μg/kg。Liu等采用乙腈提取動物組織中的巰基苯并咪唑、硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、丙基硫脲嘧啶和苯基硫脲嘧啶，并對乙酸乙酯、乙腈、丙酮、氯仿、甲醇的提取效率進行了比較。結果表明，采用乙腈提取三次后回收率近100%，并且乙腈還可以有效沉淀動物蛋白。

研究發現，硫脲嘧啶類藥物在生物基質中處于互變異構的平衡轉化中(圖19-2)。酸性基團巰基、羥基，堿性基團叔胺基的存在，也可以采用堿性或酸性溶劑提取。

圖19-2 TUs互變異構示意圖

1為主要的互變異構體

Wei等用10% HCl將血清樣品調至pH6，再加入二氯甲烷提取樣品中的甲基硫脲嘧啶和丙基硫脲嘧啶，HPLC測定。該方法的檢出限(LOD)為0.03μg/mL，LOQ為0.1μg/mL；回收率在90%～110%之間，相對標準偏差(RSD)小于5%。Perez-Ruiz等采用甲醇-1mol/L氫氧化鈉(80+20，v/v)提取飼料和尿液中的硫脲嘧啶和苯基硫脲嘧啶，經衍生化后，用毛細管電泳(CE)測定。方法回收率在75%～92%之間，RSD小于3%。Le Bizec等建立了甲狀腺中6種硫脲嘧啶類藥物的GC-MS檢測方法。采用0.1mol/L氫氧化鈉直接提取，經衍生化和凈化后測定，方法回收率在40%～70%之間，靈敏度可以達到ng/g水平。

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