聚醚類藥物殘留分析技術——凈化方法

時間：2023-03-24 21:41:31來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

聚醚類藥物殘留分析技術——凈化方法

[db:作者] / 2022-12-22 00:00

(2)凈化方法

PEs的凈化方法主要有固相萃取(SPE)、液液分配(LLP)、基質固相分散(MSPD)、和免疫親和層析(IAC)等，而SPE是采用最多的方法。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP是一種根據待測組分與非待測組分在互不相溶的兩相溶劑中溶解性不同而進行分離的經典凈化方法。溶劑、pH以及加入的離子對試劑的不同都會影響LLP凈化的效果。Moran等建立了?？墒承越M織中MON的檢測方法。組織樣品用甲醇-水(850+150，v/v)提取，提取液中再加入50mL NaCl溶液(0.1g/mL)，與二氯甲烷進行LLP凈化，收集二氯甲烷層，再經Sep-Pak硅膠柱凈化后，高效液相色譜-柱后衍生化檢測。可食性組織的LOQ為25μg/kg，回收率在80%～88%之間。Blanchflower等采用甲醇提取家禽肌肉、肝臟和雞蛋中MON、SAL及NAR，超聲10min，離心后取上清液，加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液4mL，再向混合提取液中加入等體積的甲苯-己烷(1+2，v/v)再次提取藥物，取有機層在60℃下氮氣吹干，乙腈-水溶液復溶，供液相色譜質譜分析。方法回收率在77%～113%之間，CV小于15%；線性范圍在1～400ng/mL之間，LOD低于1ng/g。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE用途廣泛，而且越來越受殘留分析工作者的青睞。SPE法的關鍵在于選擇合適的吸附劑類型及各種溶劑的用量。PEs凈化常用的SPE吸附劑有硅膠、弗羅里硅土(Florisil)、石墨化碳黑、HLB共聚物和C18等。

A.硅膠柱

Matabudul等建立了檢測動物肝臟和雞蛋中5種PEs的殘留的方法。向組織中加入無水硫酸鈉脫水后，乙腈作為提取劑提取，提取液在重力作用下過硅膠SPE柱凈化，再用2mL乙腈洗滌，收集全部留出液，40℃下蒸發濃縮至1mL，0.45um濾膜過濾后，供液相色譜-串聯質譜分析。禽肝臟和蛋中藥物的平均回收率分別在92%～118%和86%～110%之間，方法LOD為1ug/kg，LOQ為2.5ug/kg。Ward等用異辛烷～乙酸乙酯(90+10，v/v)提取雞可食性組織(肝臟、肌肉、腎臟、皮膚+脂肪)中的NAR，提取液經無水硫酸鈉脫水后，過硅膠SPE柱凈化，用二氯甲烷洗滌，二氯甲烷-甲醇(90+10，v/v)洗脫，洗脫液氮氣吹干后，用甲醇-水(90+10，v/v)復溶，過濾后，再用液相色譜檢測。方法線性范圍在0.125～1.0μg/mL之間，所有組織平均回收率在80.7%～89.0%之間，方法LOD為2.85ng/g，LOQ為7.04ng/g。張素霞等建立了肉雞肌肉、肝臟和脂肪中MON和SAL的高效液相色譜柱后衍生-可見光檢測方法。樣品組織經異辛烷提取后，用硅膠SPE柱凈化，淋洗液為二氯甲烷，洗脫液為二氯甲烷-甲醇(90+10，v/v)，收集洗脫液濃縮后，用甲醇-水溶解，高效液相色譜測定。MON和SAL的LOD分別為0.05μg/g和0.1μg/g，MON和SAL在肌肉、肝臟和脂肪組織中的平均回收率分別為97.7%、91.1%、92.1%和94.1%、85.4%、90.7%，CV在2.7%～16.8%范圍內。陳笑梅等測定雞肉中MON殘留，樣品采用甲醇-水(85+15，v/v)攪拌，超聲波輔助萃取5min，提取液過濾到分液漏斗中，再用二氯甲烷-NaCl溶液LLP，下層溶液通過無水硫酸鈉柱收集到平底磨口燒瓶中，45℃下濃縮至干，用二氯甲烷復溶后過Sep-Pak硅膠小柱進一步凈化(預先用3mL二氯甲烷浸潤)，洗脫液為5mL二氯甲烷-甲醇(95+5，v/v)。采用高效液相色譜-柱后衍生法測定。方法回收率為88.1%～101.3%，LOQ為0.02mg/kg。我國農業部于2001年發布了動物源食品中MON和SAL的殘留檢測方法標準，采用高效液相色譜-柱后衍生紫外法測定雞肌肉、脂肪、肝臟和腎臟中MON和SAL的殘留。試樣用異辛烷提取，過硅膠SPE柱凈化，洗脫液為二氯甲烷-甲醇(90+10，v/v)，高效液相色譜測定。MON和SAL的LOD分別為50μg/kg和100μg/kg；在100μg/kg添加濃度水平的回收率為80%～110%，批內CV≤10%，批間CV≤15%。

B.弗羅里硅土柱

吳荔琴等建立了雞組織中MAD的高效液相色譜熒光檢測法。肌肉、肝臟樣品用異辛烷提取，皮膚/脂肪樣品用乙腈提取，提取液在(40±2)℃水浴下蒸干，異辛烷復溶，用經異辛烷活化的弗羅里硅土SPE柱凈化，二氯甲烷淋洗，甲醇-二氯甲烷(1+9，v/v)洗脫，洗脫液在氮氣下吹干后，用乙腈復溶，衍生化后，供高效液相色譜分析。方法線性范圍為0.15～7.2μg/mL，組織添加回收率均大于70%，LOQ為30μg/kg。

C.石墨化碳黑柱

畢言鋒等建立了同時測定了雞肉中MON和SAL殘留的超高效液相色譜-串聯質譜方法。乙腈提取液過預先經二氯甲烷和乙腈活化的石墨化碳黑SPE柱凈化，提取液上柱后保持滴下速度為2～3mL/min，用二氯甲烷-甲醇(80+20，v/v)洗脫，40℃下氮氣吹干，乙腈-水(90+10，v/v)復溶，用超高效液相色譜-串聯質譜測定。MON和SAL的LOD為0.2μg/kg，LOQ為0.5μg/kg；回收率為71.9%～95.1%，批內和批間CV均小于15%。

D. HLB柱

Nasz等建立并驗證了牛奶中11種抗球蟲藥的液相色譜-串聯質譜檢測法。樣品用乙腈提取，提取液用預先經乙腈和水活化的Oasis HLB柱凈化，用水洗滌，乙腈洗脫，液相色譜-串聯質譜測定。其中，LAS回收率在93.2%～113.9%之間，LOD和LOQ分別為0.05μg/kg和0.5μg/kg。Olejnik等建立了檢測雞蛋中抗球蟲藥的液相色譜-串聯質譜驗證方法，驗證的分析物有LAS、MAD、MON、NAR、SAL、SEM等抗球蟲藥。樣品用乙腈提取，提取液在50℃下氮吹至約1mL，加水稀釋并離心后，將上清液過Oasis HLB SPE柱(預先用2mL甲醇和2mL水活化)凈化，甲醇洗脫，50℃吹干后用乙腈-水(50+50，v/v)復溶，液相色譜-串聯質譜檢測。該方法符合歐盟要求，檢測限(CCa)在2.92～ 178μg/kg范圍，實驗室內再現性CV在6.1%～29.3%之間；LOD和LOQ分別為0.04～2.62μg/kg和0.12～7.54μg/kg，回收率在90.4%～111.7%之間。

E. C18柱

Aguilar-Caballos等建立了雞肝臟中LAS的鋱(II)增敏發光檢測法。組織樣品用乙醇-36%鹽酸溶液超聲輔助萃取，過濾提取液后用水稀釋，過C18柱凈化，70%乙醇洗脫。采用SLM-Aminco Miliflow停流裝置連接SLM-Aminco Model 8100光子計數熒光光譜儀檢測。雞肝臟中LAS的回收率在95.9%～104.9%之間，LOD達2ng/g。Rosen建立了雞肝臟和雞蛋中PEs離子載體抗生素類藥物的液相色譜-串聯質譜檢測法。樣品用87%甲醇提取后，采用自動凈化步驟，SPE柱為Isolute MF C18(100mg，預先用甲醇和水活化)，80%甲醇洗滌，洗脫液為甲醇，液相色譜-串聯質譜分析。雞蛋中LAS精確度在94%～108%之間，相對標準偏差(RSD)在4%～10%之間，LOD為0.026ug/kg。

F.復合用柱

Martinez等建立了牛肝臟組織中MON、SAL、NAR和LAS的液相色譜定量檢測方法。用甲醇-水(8+2，v/v)作為提取液，過氧化鋁SPE柱凈化，用甲醇-水(8+2，v/v)洗滌，收集所有流出液與5% NaCl溶液混合，用二氯甲烷進行LLE提取，收集下層二氯甲烷溶液，48～50℃旋轉蒸干，再用甲醇-水(8+2，v/v)復溶后過Sephadex LH-20柱(預先用甲醇-水提取液活化)，收集流出液，氮吹至干。用9-蒽基重氮甲烷(ADAM)衍生化后再用硅膠柱凈化(預先用己烷濕潤，洗脫液為甲醇)，高效液相色譜-熒光檢測。方法LOD為0.15mg/kg，線性范圍為0.5～5.0mg/kg，平均回收率除LAS為57%外，其他均在70%～90%之間。宮川弘之等建立了同時檢測雞組織中MON和SAL的殘留分析方法。用乙腈提取，提取液過濾后，用乙酸乙酯和水進行LLP凈化，乙酸乙酯層在氮氣下吹干后用氯仿復溶，再過Sep-pak硅膠SPE柱凈化，淋洗液為10mL(肝臟20mL)氯仿-乙酸乙酯(9+1，v/v)，用5mL氯仿-甲醇(9+1，v/v)洗脫，洗脫液氮氣吹干，用1-溴乙酰芘(1-BAP)使SAL和MON生成熒光衍生物，氯仿溶解，再過Sep-pak弗羅里硅土柱凈化，用乙酸乙酯淋洗，丙酮-水(9+1，v/v)洗脫，洗脫液氮氣吹干后，用甲醇復溶，高效液相色譜熒光檢測器測定。方法添加回收率在66.2%～96.2%之間，LOD為50μg/kg。Olejnik等建立了同時檢測禽肝臟中12種抗球蟲藥(包括LAS、SAL、MON、NAR、MAD和SEM)的液相色譜-串聯質譜方法。用乙腈提取，向提取液中加入1mL水，混合液用預先經1mL乙腈沖洗活化后的中性氧化鋁柱脫脂凈化，再過經2mL甲醇和2mL水活化的Oasis HLB柱凈化，用1mL水淋洗，真空抽干30s，再用2mL已烷淋洗，真空抽干10min后，用2mL已烷淋洗，2×2.5mL甲醇洗脫，供液相色譜-串聯質譜測定。方法回收率在81.2%～120.1%之間；除LAS的LOD為10.9μg/kg外，其他5種PEs的LOD在0.27～2.77μg/kg之間。由于LAS在氧化鋁柱上非重現性保留，LAS的重現性低于50%，這一現象Vincent等也有提及。

3)基質固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是20世紀80年代末興起的一種樣品處理技術。將固態或液態的樣品直接與適量的反相鍵合硅膠混合并研磨，使樣品均勻地分散于固相顆粒的表面后，制成半固態裝柱，再對其進行與普通SPE類似的淋洗或洗脫等操作，以實現提取和凈化一步進行。MSPD技術具有處理樣品速度快、溶劑用量少等特點。Nasz等建立并驗證了牛奶中11中抗球蟲藥的液相色譜-串聯質譜檢測方法。MSPD所用吸附劑為Isolute C18(EC)，將2g吸附劑與0.5mL牛奶樣品混合勻漿，裝入一個底部帶濾器的注射器筒，洗脫后將洗脫液收集并在氮氣下吹干，用500μL乙腈-水(50+50，v/v)復溶，用液相色譜-串聯質譜檢測。經比較，LAS、MAD、MON和NAR洗脫液為乙酸乙酯時效果最好，其次為甲醇。方法回收率在77.1%～118.2%之間，經驗證滿足歐盟委員會決議2002/657/EC要求。

4)免疫親和色譜(immunoaffinity chromatography，IAC)

IAC根據與惰性固定相連接的抗體對某種或某類殘留組分的選擇性吸附的原理，對復雜基質樣品進行有效凈化的一種方法，現已廣泛應用于多種藥物殘留的測定。Ra等建立了雞肉中SAL和NAR的液相色譜分析法。雞肉樣品用乙腈提取，提取液用PBS稀釋后，過偶聯抗SAL抗體的IAC柱進行凈化。在重力下，滴速保持1滴/s，先后用PBS和水洗滌，甲醇-水(90+10，v/v)洗脫，洗脫液氮氣吹干后用500μL甲醇復溶，再用液相色譜-柱后衍生化檢測。SAL和NAR日內平均回收率分別在87.5%～93.1%和86.2%～94.3%之間，CV分別為4.7%～6.2%和2.4%～5.7%；日間平均回收率分別在86.0%～93.0%和86.0%～92.1%之間，CV分別為4.8%～6.5%和5.8%～7.4%；方法LOD均為2.5ng/g。Godfrey等通過酶水解作用從雞組織中提取MON。首先將1mL木瓜蛋白酶加入均質后的組織中，旋渦混合5s，37℃下孵育16h，60℃下再孵育1h，離心后取上清4℃貯存；再用IAC凈化，該免疫吸附劑由MON抗血清固定于多孔硅上制備，凈化前用PBS、乙醇和洗脫液灌注IAC柱，真空輔助溶液流下，上樣后用PBS和1%乙醇淋洗，洗脫液為含0.03mol/L鹽酸和1%(v/v)乙醇的飽和Na2EDTA溶液，最后用化學發光酶聯免疫吸附定量測定。雞不同組織中MON的LOD范圍在0.09μg/kg(肝臟)和1.99μg/kg(皮膚)之間，肝臟和皮膚的回收率分別為101.05%±10.67%和80.99%±0.19%。該IAC柱可以重復灌注再次使用。

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